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艾科试剂:单细胞凝胶电泳分析(single cell gel eletrophoresis,SCGE)的原理及特点


 
来源:http://www.aikeshiji.com
By : 艾科试剂   |  2013-11-25

单细胞凝胶电泳分析(single cell gel eletrophoresis,SCGE)是由Ostling等(1984)首创,后经Singh等(1988)进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法,适用于多种细胞,能够灵敏地检测DNA断裂,在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用价值。因其细胞电泳形态颇似彗星,又称彗星实验(comet assay)。
 
有核细胞的DNA分子量很大,DNA超螺旋结构附着在核基质中,用琼脂 糖凝胶将细胞包埋在载波片上,在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏,使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶,继而扩散到裂解液中,但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上,并留在原位。如果细胞未受损伤,电泳时,核DNA因其分子量大停留在核基质中,荧光染色后呈现圆形的荧光团,无脱尾现象。若细胞受损,在中性电泳液(pH=8)中,核DNA 仍保持双螺旋结构,虽偶有单链断裂,但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时,其断片进入凝胶中,电泳时断片向阳极迁移,形成荧光拖尾现象,形似彗星。如果在碱性电泳液(pH>13)中,先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链,单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中,电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移,形成拖尾。细胞DNA受损愈重,产生的断链或碱易变性断片就愈多,其断链或断片也就愈小,在电场作用下迁移的DNA量多,迁移的距离长,表现为尾长增加和尾部荧光强度增强,因此,通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞DNA损伤的程度。SCGE检测单细胞水平DNA损伤,无须放射性示踪,适用于各种有核细胞,样品用量少,试验周期短,故而灵敏、快速、高效。

单细胞凝胶电泳基本过程 最常用的是碱性SCGE方法。

制片:首先制备细胞悬液,然后制片。制片有3种类型:①"三明治"凝胶:是在磨毛玻璃上铺第一层5%的正常熔点琼脂 糖,第二层为细胞悬液与0.5%低熔点琼脂糖混合液(10/1),第三层为0.5%低熔点琼脂糖;②双层凝胶:不铺上述第三层凝胶;③单层凝胶:为改善其易与玻片分离的缺点,在玻片上制一凹槽进行单层灌胶。常用"三明治"凝胶。

细胞裂解
(碱性SCGE)移去胶板上的盖玻片,将胶板浸入新配置的预冷4℃裂解液(2.5M NaCL、100mN Na2EDTA 、10mN Tris -HCL PH 10、1%肌氨酸钠、用前加1%Triton和1%DMSO)中至少1h。

(中性SCGE)将胶板小心地浸入裂解液中(30mMEDTA 、0.5%SDS 、PH8.3)然后放入孵育箱中50℃4h。起始实验使用含 0.5mg/ml蛋白激酶 K的裂解液。如果裂解的时间4h或更长在50℃蛋白激酶 K对于实验敏感性是不会产生影响的。溶解后,将玻片充分清洗(250ml /10张片,洗3次)在90mMTris -90mM硼酸-2mMEDTA缓冲液。在冲洗后4~16h。

电泳:在碱性SCGE实验中,电泳前先将玻片浸没于碱性电泳缓冲液中,使DNA解螺旋,然后进行电泳。

中和、染色:用Tris缓冲液中和凝胶后,用染色剂染色。常用的染色剂有吖啶橙、溴化乙啶、PI(碘化丙啶)、YOYO-1苯并噁唑啉)等。染色后尽快检测,时间过长荧光将褪色。为了减少额外的DNA损伤与修复,应在暗淡的间接光(黄或红色)照明下进行。
图象分析:在荧光显微镜 下,观察单细胞电泳图象(放大200倍或400倍)。

细胞凋亡的研究
凋亡细胞的DNA降解以双链断裂为特征,因此中性、碱性SCGE均可用于检测凋亡细胞。凋亡过程中有内源性核酸内切酶参与,将DNA分子裂解产生180~200 或其整体倍数大小的DNA片段,在SCGE实验中呈现独特的小头大尾的形态学特征。
 

 
 
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